"Fator de transcrição AtMYB30 de Arabidopsis thaliana: influência da s-nitrosilação e alterações funcionais e estruturais causadas pela ligação ao DNA"

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica, Florianópolis, 2014.As proteínas MYB constituem uma importante família de fatores de transcrição e desempenham, em plantas, funções regulatórias no desenvolvimento e nas respostas de defesa. Exemplo importante desta família é a proteína AtMYB30 de Arabidopsis thaliana que está envolvida no início da morte celular, durante o processo de resposta de hipersensibilidade e respostas de defesa vegetal. No processo de sinalização celular, o óxido nítrico pode regular a ligação das proteínas MYB ao DNA de diversas maneiras, entre elas através da S-nitrosilação. Dessa forma, o objetivo deste trabalho foi caracterizar e avaliar a ocorrência da modificação pós-traducional S-nitrosilação no fator de transcrição AtMYB30 de Arabidopsis thaliana, sua interação com o DNA e o efeito estrutural destes fatores. Mutagênese sítio-dirigida foi usada para obter os mutantes C49A, C53A e C49AC53A. O domínio de ligação ao DNA de AtMYB30 foi capaz de ligar-se ao DNA na forma ativa, assim como os seus simples mutantes em cisteína, o que não ocorreu com o duplo mutante, comprovando a importância destes aminoácidos altamente reativo na formação do complexo. Além disso, foi confirmada a S-nitrosilação destas proteínas pela técnica de Biotin-Switch, modificação que provavelmente impediu a formação dos complexos DNA-proteína quando na presença de doadores de NO nos testes de retardamento de migração eletroforética. Utilizando o dicroísmo circular foi observado que o NO, possivelmente através da S-nitrosilação, influencia estruturalmente AtMYB30, alterando seu conteúdo de estrutura secundária, porém com certa reversibilidade ao conteúdo inicial por efeito de um agente redutor. Quando comparadas, a cisteína 49 parece ser mais importante nesta modificação estrutural, ao passo que a cisteína 53 apresenta maior afinidade com a molécula de DNA. Foi possível identificar e confirmar por espectrometria de massa MALDI-TOF a S-nitrosilação no resíduo de cisteína 53. Nos ensaios de desnaturação térmica a proteína selvagem apresentou uma temperatura de desnaturação (Tm) de 38,26 °C enquanto que os mutantes C49A e C53A foram menos estáveis estruturalmente, apresentando uma menor Tm de 32,43 °C e 31,25 °C, respectivamente. Já sob o efeito da S-nitrosilação, o perfil de desnaturação térmica da AtMYB30 selvagem apresentou um leve aumento de 3,69 ± 1,01°C na Tm quando comparado à proteína não S-nitrosilada, assim como para C49A de 33,08 °C a 39,82°C; ~6 °C. Apenas para o mutante C53A a Tm reduziu na presença do doador de NO SNOG, apresentando valores de 29.49°C a 23.15°C. Assim, a S-nitrosilação do resíduo C49 (presente no mutante C53A)promoveu o efeito mais pronunciado na sensibilidade térmica, enquanto a maior estabilidade térmica quando S-nitrosiladas foi observada em AtMYB30 selvagem e mutante C49A, sugerindo que o resíduo C49 pode ser responsável pelas modificações estruturais causadas pela adição do NO à proteína. Quanto ao efeito do DNA nos espectros de fluorescência de AtMYB30, foi observada uma redução de intensidade de fluorescência e uma alteração no comprimento de onda máximo quando na ligação entre AtMYB30 e o DNA, inclusive para as simples mutantes, comprovando a alteração estrutural causada pela ligação devido ao enovelamento da proteína. Finalmente, utilizando a técnica de DNAse footprint foi possível confirmar a sequência de ligação do DNA à AtMYB30.Abstract : MYB proteins are a family of transcription factors that play an important role in plant development and regulatory defense processes. Arabidopsis thaliana AtMYB30, a member of this protein family, is involved in cell death processes during the hypersensitive response (HR) of plants. HR is characterized by a vast production of reactive oxygen species and nitric oxide (NO). NO may thus influence the binding of AtMYB30 to DNA. In this work we evaluated the effect of NO on AtMYB30 DNA binding activity, and also on the protein structure. A fully active minimal DNA-binding domain (DBD) of AtMYB30 (residues 11?116) containing two cysteine residues (C49 and C53) was overexpressed and purified. Site-directed mutagenesis was used to obtain AtMYB30 mutants C49A, C53A and C49AC53A. The DNA binding activity of AtMYB30 and Cys single mutants was clearly inhibited upon incubation with a NO donor, and S-nitrosylation was confirmed by the biotin-switch assay. In order to understand the mechanism of the NO effect on AtMYB30 DNA binding activity we performed circular dichroism (CD) analysis, to correlate the observed protein function inhibition and a potential structural impairment on AtMYB30. Indeed, NO modification of C49 and C53 residues promotes a subtle modification of the secondary structure of this transcription factor. When compared, cysteine 49 is more important in the structural modification while cysteine 53 exhibits greater affinity with DNA. It was confirmed by Mass Spectrometry MALDI-TOF the S-nitrosylation in cysteine 49. Thermal denaturation analysis by CD indicated for wild type AtMYB30 a melting temperature (Tm) value of 38,26 °C, while for C49A and C53A, 32,43 °C and 31,25 °C, respectively and less structural stability. Following S-nitrosylation, the thermal denaturation profile of wild type AtMYB30 and C49A mutant had the Tm slightly increase when compared to non-nitrosylated protein and decreased to C53A mutant. Fluorescence spectroscopy indicated a substantially decrease intensity in all proteins when in binding to DNA, caused by protein folding in the complex. We thus demonstrated, using various techniques, the in vitro effect of NO on AtMYB30, and thus the potential consequences of NO activity on plant metabolism influenced by this transcription factor. Finally, by DNA footprint assay we were able to confirm the DNA sequence that binds to AtMYB30